Wiki de Pilar Ferraris

BLOQUE TEMATICO III

Hola aquí les dejo un diagrama que explica resumidamente sobre la PCR: usos y aplicaciones, en el diagrama podrán ver los aspectos mas importantes de esta técnica y su utilidad en diferentes disciplinas.

También les dejo a continuación un pequeño resumen acerca de la temática que se desarrolla

Link

https://view.genial.ly/6176ad0cfa77460dd6f4c3e9/interactive-content-pcr-usos-y-aplicaciones

 PCR (REACCION EN CADENA DE LA POLIMERASA)

I. OBJETIVOS

• Conocer las aplicaciones y usos de  la técnica de PCR
• Estudiar y comprender como se realiza la técnica de PCR

II. INTRODUCCIÓN 

 Es un método desarrollado por Kary Mullis.  Es un método poderoso para amplificar segmentos específicos de ADN que es diferente a la clonación y la propagación dentro de una célula hospedadora. Este procedimiento solo implica métodos bioquímicos, es decir in vitro. La PCR se basa en la habilidad de la Taq polimerasa para sintetizar una nueva hebra se ADN complementario a una hebra usada como templado. La ADN polimerasa puede agregar nucleótidos solamente al -OH del extremo 3’ preexistente, para ello la enzima necesita un primer o cebador que le brinde ese -OH. Este requerimiento permite seleccionar las regiones a ser amplificadas por la enzima. Al final la reacción de PCR, la secuencia especifica seleccionada por los primers, se encontrará en millones de copias llamadas amplicones. Su objetivo es: Obtener un gran número de copias de un fragmento de ADN particular, partiendo de una única copia de ese fragmento original, o molde, permitiendo generar cantidades limitadas de esta secuencia de interés.

¿Qué necesito para una reacción de PCR?

 Son necesarios los siguientes reactivos:

•  Agua libre de nucleasa
• Primers o cebadores (oligonucleótidos de 18 a 24 nt, llamados: Forward y Reverse) Actúan como iniciadores de la polimerización
•  Taq polimerasa
• Muestra ADN
• MgCl2
• dNTPs (dATP, dCTP, dGTP y dTTP)
•  Buffer (contiene Tris-HCl, KCl)
• Termociclador

¿Cuáles son las Etapas de un ciclo de PCR?

Desnaturalización: Se parte de ADN, el cual se desnaturaliza para separar la doble hélice. Se recomienda utilizar temperaturas de 90°C a 95°C durante 30 segundos a 1 minuto para que la totalidad del ADN se separe.

Hibridación (annealing): Las hebras obtenidas después de la etapa de desnaturalización se hibridan con un exceso de primers, que se unen a las secuencias flanqueantes de los fragmentos a amplificar. Para ello la temperatura disminuye entre los 50°C y 65°C por 30 segundos a 1 minuto. Al aumentar la temperatura o el tiempo favorece la especificidad ya que disminuye las uniones inespecíficas de los primers con la hebra molde. Si la temperatura es muy baja la unión será inespecífica y si es muy alta no habrá una unión completa

Elongación: En este paso la temperatura se eleva para que pueda actuar la Taq polimerasa, sintetizando la hebra complementaria a partir de los primers que aportan los extremos 3`OH. Esta etapa se realiza entre los 70°C y 72°C. El tiempo depende del tamaño del fragmento a amplificar. En la práctica, al terminar los ciclos se realiza una última elongación de 5 minutos a 72ºC.

Ciclos de la PCR

¿Cuántos Número de ciclos se necesitan?

Los 3 pasos descriptos anteriormente representan 1 ciclo. El número de ciclos depende de la cantidad de ADN de nuestra muestra. En cada ciclo lo teóricamente se duplica el producto de PCR. Si nuestro número es muy alto puedo amplificar un producto no deseado originado por hibridación inespecífica. Los ciclos pueden variar entre 30 y 40 ciclos

III. Bibliografía

• Jerez Belén. Informe laboratorio PCR-VNTR
• Sajantila A, Budowle B, Strom M, Johnsson V, Lukka M, Peltonen L and Ehnholm C 1992. PCR
• Amplification of Alleles at the DIS80 Locus: Comparison of a Finnish and a North American